...






                        

16:51

Culturile celulare. Tipurile. Izolarea virusurilor pe culturi de celule. Metodele de indicare si identificare a virusului izolat



Virusurile sunt cultivate pentru: Stabilirea diagnosticului etiologic; Testarea infecţiozităţii virusurilor; Testarea preparatelor antivirale; Producerea vaccinurilor

SISTEME DE CULTIVARE: Culturi de celule; Ou embrionat de găină; Animale de laborator

Animalele de laborator se utilizează limitat (receptivitate selectivă, preexistenţa infecţiilor, cost avansat). Se recurge numai când nu există alte posibilităţi (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent – şoriceii albi nou-născuţi, dar pot fi utilizaţi şobolani, cobai, maimuţe, etc.

Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infecţiile bacteriene.

Oul embrionat de găină (5-13 zile) reprezintă un mediu de celule nediferenţiate, cu multiplicare activă, steril şi lipsit de mijloace de apărare antiinfecţioasă. Se utilizează în prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)

Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la ovoscop în camera obscură.

Prelevatul se inoculează steril cu seringa în cavitatea amniotică sau alantoideană, sau pe membrana chorioalantoideană (utilizând metoda deschisă sau închisă). Orificiul se parafinează şi se incubează la 35-37 C timp de 48-72 ore

Culturile de celule. Celulele provenite din ţesuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate într-un mediu adecvat (nutrienţi, pH, t) rămân viabile şi se multiplică. Pentru cultivarea virusurilor se utilizează culturile în monostrat celular.

Tipurile de culturi de celule:

Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obţinute din ţesuturi adulte sau embrionare de origine animală sau umană. Suportă 4-6 pasaje (subcultivări)

Culturi diploide. Obţinute din ţesut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaţii

Linii continui de celule. Obţinute din ţesut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.

Obţinera culturilor de celule primar tripsinizate:

Prelevarea ţesutului (ex.: rinichi de maimuţă)

Fragmentarea şi spălarea cu sol fiziologică

Dezagregarea tisulară cu enzime proteolitice

Separarea celulelor prin centrifugare

Dozarea suspensiei 105 – 10celule/ml

Întroducerea celulelor în mediu nutritiv şi repartizarea în recipiente sterile

Incubarea până la formarea monostratului celular (inhibiţie de contact)

Monostratul poate fi infectat cu virus sau serveşte drept sursă de celule pentru o nouă cultivare (pasaj)

 

Mediile de cultură pentru culturi de celule conţin AA, Vit, factori de creştere, săruri minerale (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumină, etc), roşu fenol pentru monitorizarea pH (virează în galben în mediu acid)

Mediile de creştere sunt îmbogăţite cu ser sangvin (uman, animal) – pentru cultivarea CC

Mediile de întreţinere se utilizează pentru menţinerea monostratului în procesul reproducerii virale. Nu conţin ser.

CC reprezintă sistemul virus-gazdă predilect în virologia clinică şi cercetare.

Inocularea CC; Se aleg tuburi cu monostrat bine format; Se înlătură mediul de creştere, se spală cu sol. Hanks

Se inoculează 0,1 – 0,2 ml de prelevat; Peste 30-60 min în tuburi se toarnă câte ; 1 ml mediu de întreţinere

Se întroduc în termostat la t adecvată 3-4 zile

 

  Izolarea virusurilor in ou embrionar de gaina. Metodele de infectare. Indicarea si identificarea virusului izolat

 

Oul embrionat de găină (5-13 zile) reprezintă un mediu de celule nediferenţiate, cu multiplicare activă, steril şi lipsit de mijloace de apărare antiinfecţioasă. Se utilizează în prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)

- Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la ovoscop în camera obscură.

-    Prelevatul se inoculează steril cu seringa în cavitatea amniotică sau alantoideană, sau pe membrana chorioalantoideană (utilizând metoda deschisă sau închisă).

-          Orificiul se parafinează şi se incubează la 35-37°C timp de 48-72 ore

l  Indicarea virusului în oul embrionat de găină

Ouăle se răcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricţie maximă, apoi aseptic se taie coaja, se recoltează lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA şi embrionul se întroduc în cutii Petri sterile. Se observă:

  1. Moartea embrionului
  2. Apariţia modificărilor (hemoragii, pustule) pe MCA
  3. Acumularea de HA în lichide
® Articolele date sunt publicate in exclusivitate pe Medtorrents.com cu scop informativ.
Copierea si distribuirea materialelor este permisă doar cu indicarea link-ului către sursa originală.

56

Ar putea sa te intereseze:




Citeste mai mult la tema:




Однажды твоя жизнь будет оценена не по тому сколько денег ты заработал и сколько у тебя машин. А по тому как ты повлиял на чью-то жизнь...



  
Design by Dr. wikko © 2017