...





                        

16:47

Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul



Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica.

RFC se bazează pe fenomenul , conform căruia complexul specific dintre Ag şi Ac întotdeauna leagă complementul.

RFC cu scop de serodiagnostic prevede identificarea Ac cu ajutorul Ag.

componentele: ptr sistemul de bază: antigen (de regulă lizat), extract, haptenă, mai rar suspensia de microorganisme, anticorp: serul bolnavului, complement: serul cobaiului. ptr sistemul hemolitic: antigen: eritrocite de berbec; anticorp: hemolizina faţă de eritrocitele berbecului; soluţie izotonică.

Pregătirea ingredienţelor:

1. Serul (bolnavului sau diagnostic) în ajunul efectuării reacţiei se încălzeşte în baie de apă ia temperatura de 56°C (30 min) pentru inactivarea propriului complement.

Unele seruri, mai ales de ia animalele imunizate, posedă capaci­tatea anticomplementară, adică suit capabile de a fixa complementul în lipsa antigenului omolog. Activitatea anticomplementară a serurilor se lichidează prin prelucrare cu bioxid de carbon, prin încălzire la 57-58'C, congelare la -20°C sau -70°C şi înlăturarea sedimentului prin centrifugare, prin adaos în ser a complementului în raport 1:10 şi în­călzirea acestuia după 18-20 ore de păstrare la rece. Pentru a preveni activitatea anticomplementară a serurilor, ele se păstrează în stare liofilizată sau congelată la temperaturi joase.

2. Ca antigen pentru R.F.C. pot fi diferite culturi <ie microorganis­me omorîte, lizatele lor, componentele bacteriene, ale organelor mo­dificate patologic şi normale, lipidelor tisulare, virusurile şi materialul ce conţine virusuri. Multe antigene microbiene se obţin centralizat,

Acţiunea anticomplementară a antigenelor este atenuată prin aşa metode ca: termoliza (congelare şi decongelare multiplă), tratarea cu substanţe care dizolvă grăsimile (eter, cloroform, acetonă), alcooli (metanol, etanol ş. a.).

3. In calitate de complement se utilizează serul cobailor, proaspăt recoltat, precum şi complementul liofilizat. Pentru căpătarea soluţiei de bază şi titrarea ulterioara complementul se diluează 1:10 cu soluţie izotonică de NaCl.

4.  Eritrocitele de berbec se folosesc în suspensie da 3% în soluţie izotonică de NaCl. Sîngele (100-150 ml) recoltat din vena ju­gulară se introduce în borcan steril cu perle de sticlă, se defibrinează prin agitare timp de 10-15 min şi se filtrează prin 3-4 straturi de tifon steril pentru a înlătura fibrina. Eritrotitele se spală de 3 ori cu soluţie izotonică de NaCl, adăugând-o la sedimentul eritrocitelor pînă la volumul iniţial de strige. Eritocitele pot fi păstrate 4-6 zile la tempe­ratura de 5-6°C, Timpul de păstrare se măreşte la conservarea lor cu formalină (0,1 rol de formălină nediluată la 80 ml de sînge defibrinat) sau prin alte metode.

5. Serul hemolitic se obţine: Iepurii se imunizează prin vena auriculară cu suspensie (prealabil spălate) de eritrocite de berbec (cîte 1 ml 4-6 ori peste o zi). Peste 7 zile de la ultima injec­tare se obţine ser de probă. Dacă titrul este nu mai mic de 1:1200, se recurge la sîngerare. Serul se încălzeşte 30 min la temperatura de 56°C. Pentru a preveni contaminarea bacteriană în serul hemolitic se include conservării (mertiolat 1:10000 sau 1% de acid boric).

6. Sistemul hemolitic constă din amestec de volume egale ale seru­lui nemobilic (în titru întreit) şi 3% de eritrocite de berbec. Sensibili­zarea eritrocitelor cu hemolizine are loc la incubarea amestecului în termostat la temperatura de 37°C, 30 min.

De asemenea se efectuează titrarea componentelor:

Titrarea serului hemolitic. Serul este titrat prin amestec 0,5 ml (în diluţiile 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 ş, a.) cu 0,5 ml de 3% suspensie de eritrocite şi 0,5 ml de complement proaspăt în diluţia 1:10. Volumul amestecului pentru reacţie în tuburile de control se aduce la 1,5 ml, adăugind 0,5 ml de soluţie izotonică de NaCl. Re­zultatele reacţiei se citesc peste l oră de incubare la. temperatura de 37°C. Titrul serului hemolitic este apreciat prin diluţia maximă a lui, care manifestă o hemoliză deplină. Serul se păstrează în stare liofi­lizată.

Titrarea complementului. Anterior de efectuarea experienţei de bază soluţia iniţială a complementului (1:10) este repartizată în tuburi de la 0,05 ml pînă la 0,5 ml şi în fiecare tub volumul se completează cu soluţie izotonică NaCl  pînă la 1,5 ml. Eprubetele se includ în termostat la temperatura 37°C pentru 45 min, apoi în tuburi se adaugă sistemul hemolitic şi din nou se menţine în termostat 30 min, după ce se apreciază titrul complementului.

Titrul complementului reprezintă cea mai mică cantitate a acestuia, la adăugarea căreia în sistemul hemolititc, se înregistrează hemoliza completă în decurs de 1 oră, la 37C. In reacţie se foloseşte doza de lucru a complementului, care se ia următoarea mai mare după titru deoarece în experienţă activitatea complementului poate săs cadă pe contul adsorbţiei nespecifice a acestuia de către alţi componenţi ai reacţiei.

Titrarea antigenului. Pentru determinarea titrului antigenului se repartizează în tuburi în cantităţi descrescînde de la 0,5 la 0,05 ml aducînd volumul în ele la 1 ml prin adaosul soluţiei izotonice de NaCl. Apoi, în fiecare tub se adaugă 0,5 ml complement în doză de lucru şi se menţine în termostat l oră la temperatura de 37°C. Ulterior în toate tuburile se adaugă cîte l ml de sistem hemolitic, din nou se încubează  1 oră în termostat şi se citesc rezultatele reacţiei  Titrul antigenului se determină prin cantitatea lui minimă, în pre­zenţa căreia are loc hemoliza deplină, în R.F.C. antigenul se foloseşte în doză de lucru, ce constituie 1/2 - 1/3 din titrul lui.

Efectuarea experienţei de bază a R.F.C. Volumul total al ingredientelor reacţiei este de 2,5 ml, iar volumul dozei de lucru a fiecărui din ele - 0,5 ml. În tubul l se introduce serul în diluţia respectivă, antigenul si complementul, în tubul 2 - serul în diluţia respectivă, complementul si soluţie izotonică de NaCl (controlul serului), în tubul 3 - antigen, complement şi soluţie izotonică de clorid de natriu (controlul antigenuîui). Concomi­tent se prepară sistemul hemolitic, amestecând 2 ml de ser hemolitic în titru întreit (în comparaţie cu cel indicat pe etichetă) si 3% suspensie eritrocite de berbec (referitor la volumul iniţial al sîngelui). Tuburile se păstrează în terrnostat la temperatura 37°C (l oră), apoi în primele 3 tuburi (sistemul întîi), se adaugă cîte l ml de sistem hemolitic (sistemul doi). După o agitare minuţioasă a ingredientelor tuburile din nou sînt incubate în termostat (l oră) la temperatura de 37°C. Rezultatele reac­ţiei se citesc în prealabil după scoaterea tuburilor din termostat şi de­finitiv - după o menţinere timp de 15-18 ore în frigider sau la tempera­tura camerei.

Lectura: intensitatea reacţiei se exprimă în plusuri: (++++) - reacţie evident pozitivă, se caracterizează prin reţinerea completă a hemolizei (lichidul în tub e incolor, toate eritrocitele se depun la fund); (+++, ++) - reacţie pozitivă,' se manifestă prin coloraţia accentuată a lichidului în urma hemolizei si reducerii cantitative a eritrocitelor în sediment, (+) - reacţie slab pozitivă (lichidul e intens colorat, în sediment se observă o cantitate neînsemnată de eritrocite). In reacţia negativă (-) se observă hemoliza completă, lichidul în tub are aspect intens roz (sînge lacăt).

Aplicarea practică: Prin intermediul R.F.C. se determină anticorpii fixatori de complement în serul sanguin al bol­navilor de sifilis (reacţia Wassermann), morvă, gonoree cronică, rickettsioze, viroze ş. a.

REACŢII DE CITOLIZĂ IMUNĂ (cu participarea complementului)

Activarea fracţiilor complementului (C) duce la liza particulei purtătoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...)

Activarea complementului: Calea clasică; Calea alternativă; Calea lectinică

Activarea C pe cale clasică

Activatorul îl constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM)

Consecutivitatea activării C: Ag-Ac fixează fracţia C1qrs, care capătă ulterior activitate esterazică (în prezenţa obligatorie a Ca++). C1 activează C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertază ce acţionează asupra C3. Urmează clivarea C3 în C3a (anafilotoxină) şi C3b, care se uneşte de complex (AgAcC1C4bC2aC3b), formând C5-convertaza, care clivează C5 în C5a şi C5b. C5b se leagă de membrana celulei-ţintă. Urmează fixarea simultană a C,6,7. La final se fixează C8, apoi C9, formând “complexul de atac membranar”. Fixarea lor produce leziuni ireversibile – liza celulei.

Calea alternativă de activare a C

Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, paraziţi, venin de cobră, agregate de IgA sau IgE. C1,4 şi 2 nu intervin şi reacţia începe cu C3. Properdina, factorul B şi ionii de Mg++ sunt obligatorii în procesul de activare pe cale alternativă.

Calea lectinică de activare a C este determinată de legarea unor lectine pe unele grupări de manoză, carbohidrat prezent în componenţa multor mi/o şi absentă la ma/o. Lectina este echivalentă fracţiei C1q. Alte 2 molecule se asociază, formând o enzimă similară C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza)  Componentele reacţiilor de liză: Ag (celule bacteriene, hematii, etc). Ac (lizine - IgG şi IgM); Complement– ser proaspăt de cobai sau ser de cobai liofilizat

Reacţia de bacterioliză (RBL). Ag – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...); Ac – serul imun sau serul bolnavului; Complement

RBL in vitro: Se efectuează diluţia succesivă a serului; Se adaogă suspensie microbiană vie; Se adaogă complement (martor: Ag+ser fiziologic+C); Incubare 2 h la 37°C; Reînsămânţare pe cutii cu geloză câte 0,1 ml din fiecare diluţie (24h – 37° C). Lectura – se compară nr coloniilor crescute din martor şi probele studiate. Titrul – cea mai mare diluţie a serului în care au fost lizate cel puţin 50% din celule

RBL in vivo: Amestecul dintre Ag şi Ac se inoculează intra-peritoneal la animale de laborator  (ex.: şoareci albi); Peste fiecare 10 min, timp de o oră, se extrage lichidul peritoneal, se pregăteşte un preparat nativ şi se examinează pe fond negru sau cu contrast de fază. Rezultat pozitiv – numărul bacteriilor scade treptat până la dispariţie. Utilizarea RBL – diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL)

Reacţia de hemoliză (RHL): Ag – hematii de berbec, suspensie de 3%; Ac – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic)

Complement: Principiul reacţiei: complexele Ag-Ac formate fixează C şi-l activează pe cale clasică, provocând hemoliza. Intensitatea hemolizei se apreciază vizual (++++) sau prin măsurarea densităţii optice a hemoglobinei eliberate. Utilizarea practică a RHL: pentru dozarea C, precum şi în montarea reacţiei de fixare a complementului.

REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC). Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C. În RFC participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG. RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în  prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor

Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme.

I etapă – Sistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37° C sau menţinut 16-18 ore la 4° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C (efect frecvent invizibil).

II etapă – la sistemul de bază se adaogă sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37° C reacţia este terminată.

Evaluarea rezultatelor – dacă complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)

Complement Fixation

® Articolele date sunt publicate in exclusivitate pe Medtorrents.com cu scop informativ.
Copierea si distribuirea materialelor este permisă doar cu indicarea link-ului către sursa originală.

268

Ar putea sa te intereseze:




Citeste mai mult la tema:




Однажды твоя жизнь будет оценена не по тому сколько денег ты заработал и сколько у тебя машин. А по тому как ты повлиял на чью-то жизнь...



  
Design by Dr. wikko © 2017